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环境中病毒的检验(一)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-01-11

水体、土壤、空气以及未经烹调的肉、禽、蛋、鱼、贝、蔬菜等食品如带有能使人感染的病毒,则会给人体健康带来潜在的危险,甚至爆发某种病毒病。因此应加强对环境中病毒的检验。其重点应以经口感染的人类肠道病毒和经呼吸系统感染的呼吸道病毒为主。目前已知肠道病毒有70多个血清型,其中包括小儿麻痹(脊髓灰质炎)病毒3个型,柯赛奇A群24个型,柯赛奇B群6个型,埃可病毒34个型。呼吸道病毒如流感病毒。有时口蹄疫、狂犬病病毒等人兽共患病毒也是重点检测的对象。

检测环境中的病毒一般有三个步骤。

①样品采集和处理:包括采集、提取、净化以及必要时进行浓缩。

②病毒分离:包括接种敏感宿主(动物、鸡胚或培养细胞),如果一次未取得阳性结果,尚需盲目传代2~3次。

③病毒鉴定:常规检测环境病毒时,可根据具体要求鉴定至种或型;检验食品病毒时,只要证明分离到的确是病毒,不管分离到的是什么种或型,在食品中都不允许存在。

一、样品处理

(一)水体样品中病毒的浓集处理

水中病毒的检测难度很大,检测方法虽不少,但还没有那一种方法是通用的。不同的水体需要不同的方法,不同的病毒需要不同的细胞来培养分离,少数病毒最初还需要动物接种进行分离,有的病毒迄今尚无法培养也无敏感动物可供分离。

由于水体中病毒含量往往很少,采集的样品必须经浓集后,再将所得到的病毒接种到敏感的活细胞上培养,经繁殖分离后再用特定的抗血清及理化性状进行鉴定。因此在环境水病毒的检测中,关键步骤是如何从大量的水体中浓集极少量的病毒。常用的浓集方法有超滤法和吸附洗脱法。现将1992年10月出版的美国《水与废水检验标准方法》(第18版)中检验水体中病毒的其中2种浓集方法介绍如下。

1、用于检测大量水中极少量病毒的吸附与洗脱法

自来水等饮水可能存在有很少量的病毒,检测时必须用大量的水才能测得病毒,可采用两步法。第一步,取待测水样200~2000L,如为已加氯水样则应加适量无菌硫代硫酸钠溶液以中和余氯,加HCl使水样pH值为3.5,必要时再加适量AlCl3或MgC12溶液,然后加压使水样通过滤膜。一般用直径293mm、孔径分别为8.0μm及1.2μm的带负电荷的硝酸纤维素滤膜系列,以截留病毒。加压过滤速度不应超过40L/min。如曾加有AlCl3或MgCl3,则先用NaCl溶液冲洗滤膜以除去多余的Al3+或Mg2+,如仅用HCl则无需冲洗。用1L的甘氨酸一NaOH溶液(pH值10.5)或用3%牛肉浸膏液(pH值9.0)加压洗脱滤膜上吸附的病毒,用同一洗脱液反复洗脱5次,立即用HCl调整收集的洗脱液使pH值为7.4。第二步,再次浓集第一步洗脱液,用pH值1.5甘氨酸一HCl液调整甘氨酸洗脱液为pH值3.5,并加适量AlCl3溶液,加压通过直径47mm孔径分别为3.Oμm、0.45μm、0.25μm带负电的玻璃纤维一丙烯酸树脂滤膜系列,滤速不超过130mL/min,弃去滤液,用NaCl液洗去多余的Al3+。再用pH值10.5甘氨酸-NaOH溶液7mL加压洗脱滤膜上的病毒,连续洗脱5次,收集洗脱液立即用HCl调整pH值为7.4。如用3%牛肉浸膏液(pH值9.0)洗脱,则用两个7mL洗脱,合并洗脱液立即调整pH值为7.4。如为甘氨酸洗脱液,则加入1/10洗脱液量的10倍浓Hanks平衡盐液及10倍浓营养肉汤,再加入适量抗生素(青霉素和链霉素或庆大霉素和卡那霉素或4种都加),保存于一70℃供培养病毒之用。如为牛肉浸膏洗脱液,则滴加Hcl调整pH值至3.5并慢速混合30min,然后将此含有机絮状沉淀及病毒的洗脱液于3000g离心沉淀10min,弃去上清液,再加入适量的Na2HPO。溶液及抗生素溶液,并将此含有病毒的沉淀物充分混匀,调整pH值为7.4,保存于一70℃供培养病毒之用。

2、用于检测污水中病毒的方法

污水中存在有污泥等颗粒物质,水中病毒可吸附或包埋在此种颗粒物中,用常规方式检验时,被吸附、包埋的病毒很难洗脱下来,影响检测的结果。可采取下述方法进行洗脱。将污水分次置于250mL离心瓶内,1250g离心20min,收集上清液按常法经浓集后供检验病毒之用。再将数次的沉淀物置于一大烧杯内,在每250mL污水所生成的沉淀物中加入洗脱液40mL(洗脱液的配制:溶解牛肉浸膏10g、Na2HPO4·7H2O 1.34g、柠檬酸0.12g于蒸馏水90mL中,调整pH值为7.O,再补足蒸馏水至100mL,高压灭菌备用),用磁力搅拌器快速搅匀,调整为pH值7.O,再较慢速度继续搅动30min,pH值应保持为7.O。将此沉淀物悬液重新置于离心瓶内于4℃1250g离心5min,收集上清液供检验之用。若上清液中病毒数量少时,可按有机絮凝法进一步浓集病毒;若病毒数量多时,加适量抗生素并调整pH值7.4,保存于一70℃,可直接供培养病毒之用。

(二)底泥样品的处理

分离底泥中肠道病毒的步骤如下:①将底泥与含有硝酸钠的3%牛肉浸膏液混合,用力振摇,硝酸钠可解除病毒与底泥间的吸附,使病毒易于释放出来;②离心沉淀,弃去沉淀物;③将上清液调整pH值3.5,使形成有机絮状物,再离心沉淀,病毒即可附着在絮状物中一并沉淀下来;④弃去上清液,将沉淀物溶于少量磷酸钠溶液内,供进一步检测之用。

(三)食品样品的处理

样品送入检验室后应立即根据样品性质和检查目的及病毒的可能来源等情况进行处理。现以贝类样品的处理为例说明如下。

先以自来水冲洗全部样品,去除泥砂等污物。将贝类每10~20个分为一组,以刀撬开贝壳,倒出壳内积液(可收集起来作为一种样品),取出贝肉。将贝肉置于消过毒的匀浆机中进行匀浆处理,用10倍量pH值8.5的高抗生素Eagle’s MEM将匀浆洗出(壳内积液也作同样处理)。将洗出的匀浆猛烈摇动后重新调pH值至8.5,在室温中放置1h(每隔20min摇1min),再校正pH值至8.5,用盛有5g预先用高抗生素Eagle’s MEM处理过的玻璃棉的漏斗将匀浆过滤。再用木棒将玻璃棉及肉渣中残留液体挤出,所得液体可供分离病毒。

动物性食品中的病毒如来自屠宰后污染,其病毒浓度通常较低,大体只有1μg/g左右。病毒分离前应进行浓缩处理。

参考资料:环境中有毒有害物质与分析检测


【关键词】环境,病毒,检验,国家标准物质网 

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