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环境中抗微生物药物污染(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2017-10-10

(五)分析检测

存在于土壤、空气和水等自然环境中的抗生素,主要通过食物链对人体产生危害。其生态毒性主要表现为耐药菌的大量产生,以鸡白痢沙门菌为例,在我国部分地区20世纪60年代二耐药菌株占37.6 %,20世纪70年代四耐及五耐菌株占60.5%,20世纪80年代以五耐、六耐和七耐菌株为主(80.2 %),20世纪90年代主要为七耐菌株。对人体产生危害的抗生素主要是食品中残留的抗生素及代谢产物。对环境中抗生素的检测,重点是动物食品中的残留。

1、β-内酰胺类

β-内酰胺类药物的检测方法包括高效液相色谱法、免疫分析法和微生物测定法,目前主要应用液相色谱分析法。首先对样品进行匀浆,分离其中的β-内酰胺类药物,用离子交换柱进行。青霉素G分离柱填充料可用NovaPakCl8,流动相为0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液-乙腈(体积比,77.5∶22.5),进行柱前衍生化,在325nm波长下检测。氨苄青霉素分离柱填充料可用Phenomenex ODS-3,流动相为0.Olmol/L磷酸盐缓冲溶液(含0.015mol/L硫代硫酸钠溶液和0.02m01/L四丁基胺磺酸,pH值6.0)-甲醇-乙腈(体积比,58∶5∶37), 进行柱前衍生化,并用荧光检测器检测,激发波长为328nm,发射波长为440nm。头孢氨苄的分离柱为Supelcosil LC-18,流动相为甲醇-磷酸盐缓冲溶液(pH值7)(3∶2),检测波为254nm。

2、氨基糖苷类

氨基糖苷类抗生素极性大,水溶性好,分子量大,特别适合用液相色谱分析。链霉素、-庆大霉素、卡那霉素等检测时,将组织匀浆,用内径为4.6mm,长度为25cm的色谱分析柱,装入粒径为5μm的Ultrasphere C18填充料,进行分离,流动相为CH3OH-H2O、七氟丁酸(HFBA),流速为1.0mL/min,并用示差分析仪(RID)进行检测。

3、四环素类

四环素类抗生素容易与金属离子形成螯合物,并能在烷基键合反相填料上进行不可逆吸附,不能用甲醇、乙腈或乙醇从C18固相柱上淋洗下来,但可用弱酸性溶液洗脱,如0.01mol/L甲醇草酸溶液。

动物组织中的四环素类抗生素检测可按以下方法进行。取5g组织匀浆,分别用20mL、20mL、10mL的0.1mol/L pH值4.0的乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)-Mcllvaine缓冲溶液进行3次提取,然后离心,上清液加到Bakerl0 C18净化柱中,先用20mL水进行洗涤,再用10Ml 0.01mol/L的甲醇草酸溶液洗脱,洗脱液用高效液相色谱法进行测定。

4、氯霉素类

氯霉素类具有强的紫外吸收特性,因此可以直接用高效液相色谱法测定。

取lOg混匀的组织匀浆,加入三角瓶中,加入5g硫酸钠、20mLlmol/L乙酸钠缓冲溶 液、10mL乙酸乙酯,振摇30min,然后将其中的液体转入分液漏斗中,残渣继续用lOmL乙酸钠缓冲溶液、洗涤2次,洗液加入分液漏斗中,分出有机层。用乙酸乙酯萃取2次,每次lOmL,并将萃取液合并。用25∶1的饱和氯化钠与lmol/L乙酸钠溶液洗涤萃取液,弃去水层。有机相用无水硫酸钠脱水,在500C以下用旋转蒸发器将有机溶液蒸发至干。残渣用10mL 20%乙腈水溶液转移至分液漏斗中,加20mL石油醚,振荡lmin,使残渣脱酯,静置,分取水层,进行HPLC测定。可用内径为4mm,长度为10cm,填充料为Hypersil H5 ODS的色谱柱,流动相用pH值4.6的水-乙腈-lmol/L乙酸钠缓冲液(80∶20∶1),检测波长为278nm。

5、大环内酯类

MALs难以气化,多数具有强的紫外吸收特性,所以常用紫外高效液相色谱分析法进行测定。由于MALs含有碱性叔胺结构,在硅胶基固定相中易发生峰拖尾现象而影响分离。因此测定时,使用高纯硅胶为基体,并经端基封闭处理的C18或C8填充料作固定相。

肉品中红霉素(ERM)用碱化、乙醚进行提取,用C18/CH3CN-CH3OH-56mm01/L乙酸盐缓冲液(pH值7.0)(50∶4∶46)进行分离,用HPLC/EchD进行监测。泰乐菌素(TYL)可用CHaCN提取,用酸化十八烷基键合硅胶SPE进行净化,用C18/CH3CN-CH3OH-0.1mol/L甲酸胺(TFA调节pH值5)(3∶1∶6)进行分离,在287nm波长处用 HPLC/UVD进行测定。

6、多肽类

多数PTs类分子量较高,中等极性,弱碱性且具有一定水溶性。因此,一般多采用反相色谱法进行分析。

肉类样品可用0.5%H2SO4十八烷基键合硅胶SPE进行处理,用苯基柱/CH3CN-0.01m01/L TFA(26∶74)进行分离,杆菌肽(BAT)用HPLC/FLD(OPA柱后衍生化)340nm/455nm进行测定。

二、人工合成抗菌药物类

(一)污染来源及种类

人工合成抗菌药物污染主要来自相关工厂排放的“三废”。其次因各种目的用于畜牧生产的抗菌药物,经畜禽的粪便、尿液以及其他代谢产物排出体外后,污染土壤及水源,畜牧场产生的污水也是一个重要的污染源。保守估计,国内每年用于畜禽生产的喹诺酮类药物在500t以上,磺胺类用量更大。用于预防和治疗水生动物疾病的抗菌药物投入水体中,是造成环境污染的另一重要因素。医院的废弃物,包括污水也是一个污染源。

目前,常见的人工合成抗菌药物主要包括磺胺类、喹诺酮类和硝基呋喃类。其中磺胺类主要包括氨苯磺胺、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺异嘿唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺林、磺胺甲晤唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑等。喹诺酮类药物是继磺胺类后人类合成的作用更强的抗菌药物,抗菌作用是磺胺类的近千倍,可与第三代头孢类抗生素相媲美。其第一代药物为萘啶酸;第二代药物以吡哌酸为代表;20世纪70年代后期合成了第三代药物氟喹诺酮类,诺氟沙星(氟哌酸)为其代表,主要还包括恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、单诺沙星(DAN)、环丙沙星(CIF)、双氟沙星(DIF)、氧氟沙星(OFL)和麻保沙星(MAR)等。硝基呋喃类主要包括呋喃西林和呋喃唑酮(痢特灵)。曾经用于治疗细菌病和防治家禽球虫病,现已被抗菌作用广、疗效高及毒性低的抗生素及其他抗球虫药物所取代。

(二)理化性质

(1)磺胺类(sulfonamides,SAs) 磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称。最初是在1932年发现“百浪多息”(一种偶氮染料)对链球菌和葡萄球菌具有良好的抑制作用而发现,现已合成的超过数千种,疗效好且毒副作用小的就有几十种。SAs一般为白色或微黄色结晶粉末,无臭,基本无味。多有芳伯氨基,暴露于阳光下,日久会渐变黄,稳定性很好。相对分子质量多在170~300间。微溶于水,易溶于乙醇和丙铜,在氯仿和乙醚中几乎不溶解。因含伯氨基和磺酰氨基而呈酸碱两性(磺胺脒为碱性),可溶解于酸碱溶液中,pKa多在5~8间,等电点为3~5,少数pKa为8.5~10.5。SAs在体内的代谢途径主要包括乙酰化、羟基化和结合等三种途径。

(2)喹诺酮类(quinolones,QNs) QNs类药物,其化学结构均含有吡酮酸(1,4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸)。第一、二代药物因耐药性、抗菌谱窄、有毒副作用等,现已很少应用,现在主要应用第三代药物。其结构特点是喹啉环(个别为萘啶环)的C-6位有氟原子。QNs均为白色或淡黄色晶型粉末,多数熔点在2000C以上,盐类熔点超过3000C,游离酸形式一般易溶于稀碱、稀酸溶液和冰醋酸,在pH值6~8的水中溶解度最小,在甲醇、乙醚、氯仿等多数溶剂中难溶或不溶,盐形式易溶于水,但不溶于冰醋酸。QNs为酸碱两性化合物,酸解离常数pKa1≈6,碱解离常数pKa2≈9,等电点约为≈7,可与有机酸或有机碱形成离子对。对紫外光有较强的吸收作用,吸收峰值为240~300nm和330~350nm,该类物质自身具有荧光性。QNs还可发生一些显色反应,可与丙二酸、枸橼酸或丙烯三羧酸在醋酸中共热,呈现棕色、红色、紫色或蓝色反应。与碘化铋钾或硫氰酸铬铵反应生成有色沉淀等。

参考资料:环境中有毒有害物质与分析检测

相关链接:

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环境中抗微生物药物污染(二)


【关键词】亚治疗剂量,抗微生物药物,环境污染,药物污染,国家标准物质网 

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