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固氮细菌的测定
【来源/作者】周世红 【更新日期】2017-10-07

一、测定意义

固氮细菌是指具有能将游离的分子态氮(N2)转化为结合态氮功能的细菌。固氮细菌在自然和农田生态系统中氮素循环和植物氮素营养方面起着重要作用。充分利用微生物固定大气中的分子态氮,对减少能源消耗、保护环境具有重要意义。

二、方法选择的依据

自然界能够固定分子态氮的生物只有原核生物,包括真细菌、古细菌、蓝细菌和放线菌。

这类固氮微生物具有多种营养和呼吸类型,但以有机异养型的好气和微生物为主。固氮微生物生理类型的多样性,使得在选择培养基分离固氮微生物方面遇到了很大困难。因此,任何培养基和培养条件,都难以定量地测定出全部固氮微生物群体数量。

固氮酶是催化生物固氮过程的主要物质,它是由固氮还原酶和固氮酶两部分组成。固氮酶除了能够催化N2的还原外,还能够还原乙炔、CN-、丙二烯,N2O等。实践中,常常利用固氮酶还原乙炔为乙烯的原理,通过定量测定乙炔的还原量来表征固氮酶的活性。

土壤中结合态氮对固氮过程有反馈调节作用,而且固氮生物在固氮过程中需要大量的能量物质,原位土壤中的生物固氮主要发生在植物与固氮生物的共生体,以及植物根际,因此,土壤中生物固氮的定量测定应当涉及到植物,因其所需仪器设备比较复杂。

三、自生固氮细菌数量的测定(选择培养法)

1、方法原理

选择具有多种碳源的无氮培养基,在不供应结合态氮的情况下,通过好气和赚气培养,并应用稀释平板计数法,分别测定土壤中好气和厌氧固氮细菌的数量。然后,从平板上分离的单个菌株对乙炔的还原能力,最终确定其是否为固氮细菌。本方法测定的固氮菌涉及到9个属,是土壤中主要的固氮微生物。

2、仪器

匀桨机;一次性注射器;灭菌后的平板;能够抽真空的干燥器;钢瓶氮气,能够抽真空的容量为6mL到10mL的瓶;弯曲成锐角的玻瑞棒,气相色谱仪(带氢焰检侧器和1.5m长、直径为32mm并装有Proapak Q的不锈钢柱)。

3、试剂

(1)无氮固体培养基:首先分别配制溶液A和B。

溶液A由下列试剂组成:0.8g K2HPO40.2g KH2PO4、 0.1gNaCl、28mgNa2FeEDTA,25mg Na2MoO4·2H2O、100mg醉母膏、5g甘露醉,5g蔗精、0.5mL60%(v/v)的乳酸钠,12g纯化过的琼脂、900mL水。

溶液B的组成包括:0.2g MgSO4·7H2O和0.06gCaCl2,100mL水。这两种溶液分别在高温下灭菌(1210C,15min)。冷却后混匀,加入过滤灭菌的生物素(最终含量为5μg·L-1)和对二胺苯甲酸(最终含盆为10μg·L-1)。用灭过菌的稀酸或稀碱溶液调pH至pH7.0;

(2)无氮液体培养基:在溶液A中不加琼脂,其余均与固体培养基的配制方法相同;

(3)乙炔气体、氮气。

4、操作步骤

将灭菌后融化状态无氮培养基加入到入平板中,冷却后在300C ~370C下放置几个小时,进行表面干燥。

取10.0g新鲜土样,按10倍稀释的方法进行系列稀释至10-4。每个稀释度均分别吸取5份0.1mL~O.5 mL的土壤悬浮液,放入含有无氮固体培养基并进行表面干燥的平板上,用三角形的玻瑞棒将土壤悬浮液均匀分布在平板上。每次用完后,玻璃棒要用70%的酒精消毒、并在酒精灯上燃烧。在30℃下进行几个小时的表面干燥后,在250C~30℃下培养2d~3d。同时将用于测定厌氧固氮菌的平板放里于能够抽真空的干燥器中,先抽真空,然后充入无氧的N2,在同样温度下培养。

记录每个平板出现的菌落数,并进行菌落形态的描述。

为进一步确认平板上的菌落为固氮菌,尚需进行下列步界:无菌条件下,吸取3mL无氮液体培养基加入到灭菌的能够抽真空的玻璃瓶中。分别将各个菌株接种到每个瓶中,用胶塞封口,在250C~30℃下培养24 h。对需要厌氧培养的菌株,则要对每个瓶子抽真空,并充入过滤灭菌后的无氧氮气或氦气。培养24 h后,用注射器抽取10%的上部气体,并加入同样体积的乙炔气体。继续在25oC-30℃下培养24 h。用注射器抽取0.1mL~0.5mL上部气体用于气相色谱分析。同时按上述方法做没有接种菌株的对照。气相色谱的工作条件为:气化室温度为90oC,柱温为50℃,载气(氮气)的流速为50mL·min-1, C2H4和C2H2的滞留时间分别约为30s和60s。如果接种菌株的瓶子中乙烯的浓度是对照的2倍或3倍以上,则认为该菌株有固氮能力。若无条件,进一步确认的工作也可以不进行。

5、结果计算

菌落数g-1干土=同一稀释度5次重复菌落平均数×稀释倍数/ω

式中: ω为土样中干土所占的质量分数。

6、注意事项

土壤中的大多数固氮菌能够用本方法检出,但不是全部。对土壤中固氮菌数量结果的解释应小心谨慎,因为这些微生物是否能够在土壤中进行氮的生物固定,还取决于能量物质的供应、结合态氮的含蛋等因素。

参考资料:土壤农业化学分析方法


【关键词】土壤,固氮细菌,测定,国家标准物质网 

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