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三磷酸腺苷法
【来源/作者】周世红 【更新日期】2017-10-07

一、方法原理

不同的生物体,其细胞组成成分不一样,通过测定土壤中某些特有成分的含量,就有可能计算出土壤中微生物的生物量。目前所测定的成分包括ATP,麦角甾醇、几丁质、胞壁酸、脂多糖、磷脂类、二氨基庚二酸(DAP),DNA,RNA等,Jenkinson和Ladd指出(1981),所测定的成份必须符合以下4个条件,才能用于估算土壤微生物生物量:①该成分存在于所有的土壤微生物体内,其在微生物体内的浓度能准确地测定,同时不随生长时期而改变;②该成分仅存在于活的细胞内;③该成分能被定量地提取出来,④提取出来后能被准确地测量出来,能完全符合以上条件的微生物细胞成分几乎没有,目前大多数人认为三磷酸腺苷(ATP)基本上能够满足以上4个条件。

ATP是所有生命体能量贮存物质,业已发现ATP只存在于活的细胞组织中,细胞死亡后ATP迅速分解。定量地从土壤中提取出ATP是该方法的最大困难。有效的土壤ATP浸提剂必须符合3个条件:①使细胞中ATP完全释放出来,②能够钝化ATP水解酶的活性,③使ATP免于被土壤胶体吸附。目前所用的浸提剂包括无机和有机酸、有机和无机盐等,没有一种能完全符合以上3个条件。目前广泛应用的浸提剂是三氯乙酸-Na2HPO4-百草枯混合溶液。浸提液中ATP与荧光素-荧光素酶系统反应释放出光子,所释放的光子可用液体闪烁计数仪、荧光分光光度仪或生物发光计等仪器来测定。

二、仪器及设备

超声波细胞破碎机150 W;液体闪烁计数仪。

三、试剂

(1)c(ATP)=0.1mmol·L-1标准溶液(母液):59.9g三磷酸腺苷二钠盐溶于1000mL去离子水中,此溶液应在冰室中保存。用此母液加浸提液A配制0μmol·L-1、0.2μmol·L-1、0.4μmol·L-1、O.8μmol·L-1、1.0μmol·L-1、1.6μmol·L-1、2.0μmol·L-1、2.4μmol·L-1、3.0μmol·L-1、4.0μmol·L-1、ATP工作液;

(2)浸提液A:0.5mol·L--1三氯乙酸+0.25 mol·L-1 Na2HP04+0.1 mol·L-1百草枯,在冷冻室中保存;

(3)浸提液B:每升浸提液A中加入ATP标准溶液(试剂1)5mL,在冷冻室中保存;

(4)缓冲液:c(Na2HASO4·7H2O)=0.1mol·L-1+c(C10H14O8N2Na2)=0.002mol·L-1+c(MgSO4·7H2O)=0.01 mol·L-1,用硫酸溶液[c (HZSO4)=1mol·L-1]调节pH为7.4;

(5)荧光素与荧光素酶溶液:10mg荧光素与荧光素醇的混合物溶于8mL新鲜蒸馏水中,每毫升加入荧光素0.5mg,混合均匀,此溶液易变化,用前约10min配制,并且放在冰浴中备用。

四、操作步骤 1、称取相当于烘干土重2.5g的湿润土壤6份,放入50mL塑料离心管中,其中3份准确加入25 mL浸提液A,3份准确加入25mL浸提液B,立即用超声波细胞破碎机处理(或在冰浴中存放))2min,放入冰浴中冷却至少5min,迅速过滤,滤液应迅速测定或在一150C下保存。同时做不加土壤仅加浸提液A和浸提液B的空白对照。

2、浸提液中ATP的测定向25mL的计数瓶中加入5mL缓冲溶液,再加50μL土样浸提液,混合后加入60μL的荧光素与荧光素酶溶液,轻轻地混合均匀,立即放在液体闪烁计数仪上测定,计数时间为0.1s,重复计数2次。在样品之前和之后分别测定ATP标准溶液。

五、结果计算

ATP(mmol·kg-1)=(b-a) ×f×r/m

式中:a——样品浸提液A所测定的ATP浓度(μmol·L-1);

b——样品浸提液B所测定的ATP浓度(μmol·L-1);

f——稀释倍数;

r——加入的ATP回收率(%);

m——烘干土坡质量(g)。

其中:

R=(bs一as)/(bb-ab) × 100

式中:bs——样品浸提液B的侧定值;

As——样品浸提液A的测定值;

bb——浸提液B的空白对照测定值;

ab——浸提液A的空白对照测定值。

参考资料:土壤农业化学分析方法


【关键词】土壤,三磷酸腺苷法,国家标准物质网 

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