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反硝化菌数量的测定
【来源/作者】周世红 【更新日期】2017-10-05

一、测定意义

微生物反硝化过程,又称呼吸反硝化过程,是好气异养菌在无氧或微量氧的条件下,利用同一个电子传递系统,以硝酸、亚硝酸或其他氮氧化物作为电子受体,并将其最终还原为N2O或N2,从而导致氮素的气态损失。

二、方法选择的依据

能够进行生物反硝化的微生物主要是细菌,近几年的研究表明真菌也能够进行反硝化作用。其中,起主要作用的是化能异养型的好气细菌。除需要无氧或微量氧条件外,反硝化细菌还偏要碳源、电子供体和氮氧化物。参与反应的氮氧化物异化还原酶可受到氧、乙炔、含硫氧化物等的竞争抑制。

测定反硝化微生物活性的方法很多,但均需要较复杂的仪器和设备条件。

三、测定方法(最大可能计数法)

1、方法原理

反硝化过程对NO3消耗的速率显著大于土壤中其他生物化学过程对NO3的利用,因此可通过在适宜的培养条件下,测定介质中NO3+NO2-的消失,利用最大可能计数法初步估计反硝化微生物的数量。然而,在某种情况下,仅靠测定NO3- +NO2-的利用状况,不能完全确定有无反硝化微生物的存在,其原因是:①有其他利用NO3-+NO2-的过程存在,NO3-+NO2-的消失并不一定意味粉反硝化微生物的存在;②尽管NO3-+NO2-没有被完全利用,而反硝化过程仍然有发生。因此,需要利用乙炔能够抑制反硝化过程中N2O还原为N2的原理,通过检测通入乙炔气体后N2O的存在与否,以确定反硝化微生物的存在。

2、仪器

匀桨机一次性1mL注射器;16mm ×125mm带有丁基橡胶隔膜螺口试管。

3、试剂

(1)液体培养基:称取5g蛋白陈,3 g牛肉青和0.5g KNO3,溶于1L水中。取10mL该培养基于16mm ×125mm的螺口试管中,高温灭苗。

(2)稀释剂:1000mL水中加入8.5g NaCI,高温灭菌。

4、操作步骤

取10.0g新鲜土样、90 mL灭菌后的稀释剂和一滴非离子活性剂(Tween 80)加入到匀桨机中,搅拌2min,然后按方法进行系列稀释至10--3到10-1。从最高稀释度土壤悬浮液起选择5个连续稀释水平,用一次性3mL注射器各取5份(即5次重复),每份0.1mL,分别注射到灭过菌的装有10mL液体培养基的试管中。在250C~30℃培养14 d后,用二苯胺试剂定性检侧NO3和NO2- 。操作方法是:取0.1mL ~1mL茵悬液,逐滴加入6滴二苯胺试剂,此时出现蓝色愈味着有NO3或NO2-存在;无色则表明可能发生了反硝化。当待测液中只有NO2-存在时,褪色较快。

5、结果计算

记录最后检测的每个稀释度中无NO3和NO2-反应的试管数,计算反硝化细菌群体的数量。

结果以每克干土的反硝化细菌个数表示。

6、注意事项

(1)加入二苯胺溶液时一定要逐滴进行,以防止氧化的发生并导致反应中止。

(2)本实验的测定结果,对随环境变化而有所变化的反硝化细菌的数量,能够有所了解,却难以反映土壤中的反硝化强度,因为参与反硝化过程的酶均是诱导酶,在能够进行反硝化过程的条件存在时,才可产生。在田间情况下,反硝化强度主要与土壤的氧分压、电子供体的数量及NO3的浓度等有关。

参考资料:土壤农业化学分析方法


【关键词】微生物、反硝化、微量氧、国家标准物质网 

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