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核磁共振波谱法(三)
【来源/作者】周世华 【更新日期】2017-07-11

五、实验技术

1、样品制备

要想获取只保留分子内部结构信息的分辨程度很高的谱图,一般应采用液态样品。凡固体样品须先在合适的溶剂中配成溶液,溶液浓度尽量浓些,以便减少测量时间,但不宜过于黏稠。凡液态样品,为减少分子间的相互作用而导致谱线加宽,常需用惰性溶剂稀释,使其有较好流动性。合适的溶剂应黏度小、溶解性能好,不与样品发生化学反应或缔合,且其谱峰不与样品峰发生重叠。常用的氘代溶剂有CDCI3,D20,其次是(CD3)2CO,(CD3)2SO,C6D6,C5D5N,CD30D等。

欲观察位于高场的甲基、亚甲基等基团应尽量避免使用丙酮、乙醇、二甲亚砜等。对含芳香族质子的样品应尽量避免用氯仿及芳香族化合物的溶剂。不同溶剂由于其极性、溶剂化作用、氢键的形成等而呈现不同的溶剂效应。例如苯作溶剂时,因其各向异性的屏蔽现象常引起高场位移,而丙酮、二甲亚砜等溶剂易形成分子间氢键,导致试样的低场位移。CF3COOH是极强的极性溶剂,它对含多羟基的化合物易引起脱水反应。

样品溶液中不应含有未溶的固体微粒、灰尘或顺磁性杂质,否则会导致谱线变宽甚至失去应有的精细结构。为此样品应在测试前预过滤,除去杂质。必要时应通氮气逐出溶解在试样中的顺磁性的氧气。

2、标准参考样品

测量试样的化学位移必须用标准物质作参考,按标准参考物加入的方式可分为外标(准)法和内标(准)法。

外标法是将标准参考物装于毛细管中,再插入含被测试样的样品管内,同轴进行测量。其优点是标准参考物谱峰位置不会由于标准物与样品或溶剂间的分子相互作用而发生偏移。当标准参考物与溶剂互不相溶,又对化学位移精确度要求不高时,可用此法。其缺点是参考物与样品的磁化率不同,应对化学位移进行校正。

内标法是将标准参考物直接加入样品中进行测量。作为内标准的物质,应有高度的化学惰性,即不与溶剂和样品分子起化学作用,却易与它们混溶,且易挥发而便于回收样品,当然还有易于识别的谱峰。对氢谱而言,通常用四甲基硅(CH3)4Si(简称TMS)作内标。它有12个等价质子,只有一个尖锐单峰,出现在高场,一般化合物的谱峰都在它的左边,故规定它的化学位移艿为零。若采用其他参考物,如苯、氯仿、环己烷等,都必须换算成以TMS为零点的艿值。TMS化学惰性,沸点(27℃)很低,回收样品时很容易挥发除去,因此作为标准很合适。在用D2O作溶剂的样品溶液中,因TMS在水中不溶,可用4,4’-二甲基-4硅代磺酸钠((CH。)。Si(CH。)。一SO。Na,简称[)SS)为内标。

不同核素所用的标准参考物不同。13C核与29Si核皆用TMS,常用内标法来测定。而31P核用85%磷酸,常用外标法来测定,即将它封在毛细管内,与插入实验管内的试样一起测量。

标准参考物的用量应视试样量而定,控制在使其峰高于噪音峰值的几倍,但不应超过被测物中最高峰为宜。

3、图谱解析

(1)对于一张合格的NMR谱图作解析时,先应判断图中的参考标准物峰、溶剂峰、旋转边带及杂质峰。利用峰面积积分值的比例是否存在简单的整数比关系来判断是否有杂质峰。

(2)根据谱峰的化学位移值,可以粗略判断它们所属基团或可能的基团。由1H谱积分值求出各峰所含1H原子的数目之比,初步确定各基团所含1H数目。可先从特殊的、简单的峰人手。如先寻找无耦合关系的孤立信号(单峰)的基团C-NMR定量谱的积分值基本反映了碳原子数目。

(3)复杂谱峰的氢谱应仔细分析。在多重峰、复杂峰中寻找等间距峰的关系及耦合常数,用以寻找基团之间的耦合关系。先考虑一级谱中有简单耦合关系的基团,然后再分析复杂的耦合体系。

(4)当1H积分总数与已知条件矛盾时,要考虑分子内在对称性,否则应考虑低场质子或活泼氢,如OH,NH2,NH,SH,COOH等是否会遗漏,或者有杂质混入或是否存在着异构体。可以利用活泼氢的谱峰加重水,经化学交换会消失(但分子内氢键不消失)来判断。

(5)已知化学分子式,应计算其不饱和度,了解可能存在的环及双键数目。

(6)对复杂谱或用常规谱分析不能确定分子结构,或为特殊研究目的,有必要采用各种相应的简化手段或采取特殊的脉冲序列作进一步实验,以便寻找分子内各基团间的相互关联。这些实验包括:改变溶剂,加位移试剂,改变磁场强度,变温测谱;各种双共振实验(如同核的自旋去耦,自旋微扰,核的欧佛豪斯(Overhauser)效应实验;对于异核的有对1H全去耦、选择性去耦、偏共振、各种门控去耦实验;用特殊的一维与多维脉冲序列来获取具有特定信息的各种谱图的实验(如可确定甲基、亚甲基、次甲基、季碳的APT①、DEPT②);确定分子中碳构架的1D或2D—INADEQUATE(incredible natural abundancedotlble quant-um transfer experiIhent)谱,表明分子内经化学键联的基团之间相互关系的二维的2D-J谱、2D-同核和异核的COSY(correlation spectroscopyr)相关谱、2D-长程耦合谱、总相关谱(total correlation spectroscop5r,TOcsY)、检测氢的异核多量子(单量子)相干谱(HMQC,(HSQC)、多键相关谱(1Hdetected1aeterontlclear multiple bolld coheience,HMBC),用于分子内或分子间基团空间相关的2D-NOE相关谱(mlclear OverhaI]seeffect spectroscopy,NOESY),等等。

(7)综合每个峰组的δ,J,积分值,合理地对各峰组的氢原子、碳原子数进行分配,确定各基团,由核之间的直接耦合与长程耦合关系等推断相应的分子片断或若干结构单元,将它们再组合成可能的一个或数个完整的分子。并从可能的分子结构推出各基团的峰位与峰形,验证结构式的合理性,剔除不合理的结构式。合理的结构式应能正确指认谱图各峰及其互相关系。必要时合成出推定的化合物,作出谱图加以对比,最终确证。

六、 NMR常用脉冲技术(脉冲序列)及其功能

脉冲傅里叶变换(pulse Fourier transform,PFT)方式的应用不仅大大提高了灵敏度,成功地使测量低灵敏度的13C核的NMR谱成为例行的分析,更重要的是利用PFT方式可设计出形形色色的特殊脉冲序列,包括一维、二维乃至多维的,用以直接认识谱峰所属特定的化学基团,同核及异核之间的短程、长程耦合关系,识别极其复杂的1H谱,了解分子中各基团与骨架原子之间的连接关系,从而获知分子结构,如生物大分子的一级结构;还可了解分子内、分子间各基团的相互作用力,如范德华力、氢键等,进一步了解生物大分子的二级、三级结构;现在已发展了研究包括非晶态的固体物质的固态NMR法与医用的多种核磁共振成像(nuclear magnetic resonance imaging,NMI)法。因此脉冲技术的应用或脉冲序列的设计在NMR方法发展中显得特别重要。这里我们仅极其简单地介绍一下最常用的脉冲序列及其功能。

PFT-NMR的脉冲序列采用时序图来描述是简明的方法。例如常规的1H谱表示如图12.2所示。图中有多次脉冲重复,可只画出脉冲作用的1~3个周期即可。由于射频发射与接收同在观察通道但分时进行,简便起见,可画在一起。通常观测用的射频场称为B1,而对同时引人作为辐照去耦等之用的另一射频场称为B2。两者同时采用使体系两种核发生共振的技术是双共振方法。若观测核为A,辐照核为X,常常表示为A{X}。双共振的时序图应将观测核与辐照核的脉冲序列按时间先后并列画出。下面介绍一些常用的重要的脉冲序列。

(一)同核双共振

1.同核自旋去耦(homonuclear spin decoupling,HOM)1H谱

HOM脉冲序列时序图如图12.3所示。观测道在每个射频脉冲发射后产生的FID由计算机采集并随即储存。在储存期间交替打开接收机门与去耦辐照射频发射门,即分时进行。所用辐照频率是针对特定的谱峰位置而设定的。这时辐照场B2是脉冲间隔足够小的梳状脉冲,其分立的频谱分量中有某单一频率分量恰好对准欲去耦的特定谱峰,而其他的分量皆超出1H谱范围之外,于是:

被辐照的谱线所对应的特定跃迁因饱和而谱线几乎消失,与之相关的耦合谱线便消除耦合裂分。在结构分析中可用于简化图谱,寻找耦合关系,寻找复杂谱图中所隐藏信号的位置,也可用于消除和抑制试样中的大的溶剂峰。适当调整去耦功率时可用于自旋微扰与核间共振等实验。

参考资料:现代仪器分析实验与技术


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